摘要

 本文比較分析了國(guó)內(nèi)外李斯特菌的檢測(cè)方法、不同標(biāo)準(zhǔn)限量值的差異。介紹了國(guó)內(nèi)外李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及存在的問(wèn)題，對(duì)我國(guó)微生物快速檢測(cè)的現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，探討了李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)的未來(lái)發(fā)展方向，對(duì)李斯特菌檢驗(yàn)方法探索及快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有一定的借鑒意義。

一、李斯特菌介紹

李斯特菌（Listeria spp.）廣泛存在于環(huán)境中，并且在很多食品有檢出，該菌在低溫的條件下仍能存活和增殖，其中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是食源性疾病的主要致病菌之一，也是食品安全控制的重要病原體，感染后會(huì)造成不同程度的人員死亡，受到各國(guó)的高度重視。傳統(tǒng)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力而靈敏性較差，因此，快速、高效、靈敏可信的檢測(cè)方法能夠更加有效判定李斯特氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)并且控制其危害。

二、李斯特菌的污染及危害

李斯特菌在環(huán)境中普遍存在，也是污染食品的主要病原菌，往往侵染肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食品。其中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是食源性疾病的重要病原菌， WHO將其列為21世紀(jì)四大食源性致病菌之一。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛存在于土壤、人和動(dòng)物的糞便中，在4℃的環(huán)境中仍能生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品中主要的病原菌之一，往往污染食品導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)。近年來(lái)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病事件時(shí)有發(fā)生，并造成不同程度的人員死亡，受到各國(guó)的高度重視。

三、國(guó)內(nèi)外李斯特菌限量規(guī)定

李斯特菌極容易污染食品，其中冷藏食品和即食食品危害最為嚴(yán)重，各國(guó)均制定了食品中李斯特菌的限量值和監(jiān)測(cè)計(jì)劃。美國(guó)對(duì)即食食品中單增李斯特菌的限量規(guī)定為0/25g，并要求企業(yè)實(shí)施GHP和HACCP。中國(guó)大陸2013年頒布的《食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)GB29921-2013》中規(guī)定，在即食肉制品中，單增李斯特菌按照二級(jí)采樣方法取樣不得檢出（n=5，c=0，m=0）。

四、李斯特菌主要檢驗(yàn)方法

目前，食品微生物檢測(cè)體系主要包括，中國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB4789）和檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN）、國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）方法、美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（FDA）、美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）、美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）、加拿大健康保護(hù)部（MFLP）、歐盟食品安全局(EFSA)等檢測(cè)體系。

食品中單增李斯特菌(Li. monocytogenes)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括增菌、分離和鑒定3個(gè)環(huán)節(jié)。目前，分離環(huán)節(jié)常會(huì)采用顯色培養(yǎng)基，使其菌落顏色不同于其它干擾菌，實(shí)現(xiàn)快速分離。鑒定常采用生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)。目前，生化反應(yīng)的鑒定技術(shù)多采用數(shù)值分類鑒定和自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。

五、李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力操作要求高，因此，李斯特菌快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)是必要的。美國(guó)、歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)微生物快速檢測(cè)方法的研究和產(chǎn)品認(rèn)證體系相對(duì)成熟，各種不同的快檢系統(tǒng)和自動(dòng)化儀器被推出，并得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，李斯特菌快速檢測(cè)方法為增菌以后，生化鑒定之前，對(duì)樣本進(jìn)行快速篩選，以縮小檢測(cè)范圍，減少檢測(cè)任務(wù)，提高檢測(cè)效率?？焖贆z測(cè)方法主要包括酶底物顯色技術(shù)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)三大類。

1、即用培養(yǎng)技術(shù)

即用培養(yǎng)基技術(shù)則省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接檢測(cè)樣品，從而節(jié)約了大量人力成本。目前，商業(yè)化的固定培養(yǎng)基技術(shù)主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養(yǎng)基固定于紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計(jì)數(shù)。即用平皿法是指用已倒有培養(yǎng)基的平皿，接種操作與傳統(tǒng)涂板、劃線法一樣。其優(yōu)點(diǎn)和紙片法一樣，即省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接接種培養(yǎng)。此類產(chǎn)品主要有3M的Petrifilm試紙片、    良潤(rùn)生物的MicroFast®測(cè)試片、北京陸橋的Easytest 系列產(chǎn)品及綠洲生化的微生物測(cè)試片等，已被許多研究被證明與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差別。

2、免疫學(xué)檢測(cè)法

該技術(shù)以抗原抗體免疫為基礎(chǔ)，制備特異性克隆抗體檢測(cè)細(xì)菌。目前國(guó)內(nèi)外李斯特菌快速檢測(cè)的此類技術(shù)主要包括：酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)、金標(biāo)免疫層析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)等。ELFA 靈敏度比ELISA 高，并省去了ELISA 中的顏色反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間；但缺點(diǎn)是成本較高，目前主要應(yīng)用在自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)(VIDAS)上。金標(biāo)免疫層析技術(shù)是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上，且可與固相支撐基質(zhì)相分離。當(dāng)檢測(cè)樣品中存在李斯特菌時(shí)，測(cè)試單元的試劑將會(huì)被展開(kāi)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的確定性反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)。該檢測(cè)技術(shù)平均1min 即可得到檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需培養(yǎng)和樣品制備，靈敏度可以達(dá)到1～100CFU，但儀器投入較大，檢測(cè)成本相對(duì)較高，對(duì)樣本的要求高，嚴(yán)重的制約這該技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。

3、分子學(xué)檢測(cè)方法

主要包括核酸探針雜交技術(shù)、PCR 檢測(cè)技術(shù)等。DNA 探針?lè)ㄊ菍? 條堿基互補(bǔ)的DNA 鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交，通過(guò)檢測(cè)樣品與標(biāo)記性DNA 探針之間形成的雜交分子來(lái)檢測(cè)樣品中的單增李斯特菌，測(cè)定放射性或熒光強(qiáng)度即可得出樣品中單增李斯特菌的個(gè)數(shù)。PCR 是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，在單增李斯特菌的檢測(cè)中以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列（常用的靶序列包括hly、actA、prfA等）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。該方法特異性好，但靈敏度低，對(duì)樣品進(jìn)行前處理后再進(jìn)行擴(kuò)增，可以提高檢出率和檢測(cè)靈敏度。國(guó)內(nèi)外目前主要應(yīng)用的PCR技術(shù)包括：實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-timePCR)、多重PCR、恒溫?cái)U(kuò)增、RT-PCR 方法、IMS-PCR檢測(cè)技術(shù)等。

4、增菌快速檢測(cè)技術(shù)

不管是國(guó)標(biāo)GB方法還是ISO、FDA等方法，李斯特菌檢測(cè)必須經(jīng)過(guò)2次增菌后再進(jìn)行分離鑒定，操作比較繁瑣，操作過(guò)程容易造成污染，且耗時(shí)較長(zhǎng)。MicroFast®李斯特菌快速增菌培養(yǎng)基為一步增菌培養(yǎng)基，即在檢測(cè)擴(kuò)增李斯特菌的過(guò)程中不需要二步增菌，因此操作性更方便。

具有如下優(yōu)點(diǎn)：

（1）對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行增菌檢測(cè)

在450個(gè)食品樣本中添加一定量李斯特菌，建立感染模型，分別用FM快速增菌培養(yǎng)基和國(guó)標(biāo)法規(guī)定對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行增菌檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FM培養(yǎng)基對(duì)李斯特菌復(fù)蘇效果顯著，尤其是檢測(cè)冰激凌、奶酪類產(chǎn)品，具體對(duì)比如表2所示。

（2）擴(kuò)增速度更快速 

通過(guò)實(shí)驗(yàn)間比對(duì)李斯特菌在四種不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度，發(fā)現(xiàn)李斯特菌在MicroFast®培養(yǎng)基（以下稱MF）中具有最快的生長(zhǎng)速度。 

（3）具有更強(qiáng)的選擇特異性 

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，該培養(yǎng)基可以抑制絕大多干擾菌的生長(zhǎng)（1/115，即115株非李斯特菌種僅有1株能夠生長(zhǎng)）。

六、小結(jié)

微生物檢測(cè)包括前處理、增菌、富集、檢測(cè)等環(huán)節(jié)。為實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)食品微生物，每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)有相應(yīng)的篩查技術(shù)及產(chǎn)品。我國(guó)在微生物快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及技術(shù)研發(fā)方面相對(duì)歐洲國(guó)家比較落后，快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用需要政府相關(guān)機(jī)構(gòu)、科研單位、企業(yè)共同的努力建立一套快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的檢測(cè)體系，此外，還需要降低檢測(cè)成本，提供檢測(cè)靈敏度和實(shí)用性，這些是今后微生物快速檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。

（內(nèi)容來(lái)源實(shí)驗(yàn)與分析）