本文主要介紹在色譜實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常遇到的保留時(shí)間不穩(wěn)定問(wèn)題，不同現(xiàn)象的解決方法如下。

一、用的同一臺(tái)儀器同一根色譜柱同一瓶流動(dòng)相，保留時(shí)間在同一天變化大

1、首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來(lái)檢測(cè)流速，具體方法是設(shè)置儀器流速1ml/min，用10ml量筒收集流出液10分鐘，應(yīng)該得到液體約10ml±0.5ml，量筒有誤差，使用的試劑與儀器廠家標(biāo)定泵流速時(shí)試劑不一樣，最終體積也有些差異，如果超過(guò)這個(gè)范圍，再分開(kāi)通道檢測(cè)，以找到流速不正確的原因并排除。

2、檢查流動(dòng)相組成是否變化，可以在流動(dòng)相中加入跟蹤劑來(lái)觀察基線的變化，例如反相條件UV檢測(cè)器，在有機(jī)相中加入0.1%丙酮，監(jiān)測(cè)254nm下的基線變化。還有一種方法人工配制流動(dòng)相，然后通過(guò)混合器，這時(shí)候保留時(shí)間穩(wěn)定了，不再波動(dòng)，那就是混合器工作不正常，或者混合不均勻，進(jìn)行排除。

二、保留時(shí)間一天之內(nèi)正常，不同天數(shù)之間變化

1、可能是流動(dòng)相的組成變化引起的。在反相色譜中，保留因子k和流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑的體積含量成指數(shù)關(guān)系，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果有機(jī)溶劑含量誤差在1%，那保留時(shí)間的變化在5%-15%之間，大部分變化在10%左右，意味著用稱(chēng)量有機(jī)溶劑的方式配置流動(dòng)相能得到更穩(wěn)定的保留時(shí)間。

2、也可能是流動(dòng)相的脫氣方式導(dǎo)致的。最好的脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右，非真空條件下超聲脫氣5分鐘，這樣會(huì)最大程度的減少溶劑的揮發(fā)。還有一種方法是流動(dòng)相中通過(guò)氦氣，流動(dòng)相被氦氣平衡后，氦氣流立刻關(guān)閉，避免氦氣帶走溶劑蒸汽，而導(dǎo)致溶劑組成改變。

3、流動(dòng)相的抽濾方式。通常情況下如果我們使用有機(jī)溶劑和水相混合流動(dòng)相時(shí)，會(huì)先將流動(dòng)相配置混勻好后，再進(jìn)行抽濾，這樣的好處是流動(dòng)相混合更均勻，但是對(duì)于流動(dòng)相中沸點(diǎn)較低的部分，在抽濾過(guò)程中會(huì)損失更大，導(dǎo)致流動(dòng)相溶劑組成改變，建議有機(jī)相和水相分開(kāi)抽濾，再進(jìn)行混合，超聲脫氣。

4、流動(dòng)相的PH值。檢測(cè)目標(biāo)物是離子狀態(tài)或者離子化的，那么控制流動(dòng)相的pH就非常重要，就算是0.1單位pH的變化都有可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移10%左右，所以準(zhǔn)確稱(chēng)量pH值并保證pH儀被很好的校正了，在反相色譜柱中，隨著pH值的升高，酸的保留會(huì)減少，堿的保留會(huì)增加。反相色譜中，分離離子或離子化的樣品，保留時(shí)間會(huì)受到正確緩沖溶液的離子強(qiáng)度的影響，但影響會(huì)很小，可以不計(jì)，典型狀況是緩沖鹽的摩爾數(shù)改變20%，保留時(shí)間的變化是1%，緩沖鹽的組成通常是稱(chēng)量的，那么大的誤差是不會(huì)發(fā)生的。

三、保留時(shí)間漂移

1、如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜，平衡是最有可能的原因，使用半飽和流動(dòng)相改善。反相色譜中，平衡通常會(huì)很快，5-10個(gè)柱體積的流動(dòng)相通常就足夠平衡了，但不全是如此，典型的就是離子對(duì)色譜中，使用離子對(duì)試劑平衡色譜柱，由于離子對(duì)試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料表面，表面濃度在0.5-2μmol/m2，1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對(duì)試劑進(jìn)行完全的柱平衡，流動(dòng)相濃度為2mmol時(shí)，那需要1L流動(dòng)相進(jìn)行平衡，這個(gè)雖然是極端條件，但是用幾百毫升的流動(dòng)相去平衡色譜柱也是正常的，因此離子對(duì)色譜中，使用了有機(jī)溶劑清除了離子對(duì)試劑，這樣第二天需要更長(zhǎng)的時(shí)間平衡色譜柱。這兩個(gè)現(xiàn)象都是流動(dòng)相中有低濃度的強(qiáng)吸附試劑導(dǎo)致的，這是保留時(shí)間漂移最常見(jiàn)的原因。

2、樣品中含有強(qiáng)吸附劑，在重復(fù)進(jìn)樣中會(huì)慢慢累積，從而改變色譜柱的化學(xué)性質(zhì)，如藥品的賦形劑?？梢酝ㄟ^(guò)觀察保留時(shí)間變化的速率來(lái)得知雜質(zhì)是從流動(dòng)相中引入還是樣品中引入。

3、鍵合相水解。色譜柱制造商會(huì)制定一個(gè)pH范圍，超出范圍可能導(dǎo)致鍵合相不穩(wěn)定，但是很多情況下使用者不得不接近這個(gè)pH極限。水解還取決于其他因素，如溫度，有機(jī)溶劑，緩沖鹽的濃度和種類(lèi)，樣品的化學(xué)性質(zhì)等，因此水解也可能發(fā)生在這個(gè)pH范圍內(nèi)。要保存固定相的水解穩(wěn)定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低溫下。等度條件穩(wěn)定性?xún)?yōu)于梯度條件，在等度條件下發(fā)生水解的過(guò)程中，鍵合相通常會(huì)發(fā)生自我吸附，并達(dá)成一種區(qū)域平衡，在使用高濃度的有機(jī)溶劑時(shí)，在梯度時(shí)或者沖洗色譜柱時(shí)，這種平衡會(huì)被打破，鍵合相被沖出色譜柱。

4、溫度的變化。如果樣品是自動(dòng)分析過(guò)夜或者過(guò)了周末，那保留時(shí)間的漂移可能和實(shí)驗(yàn)室的溫度變化有關(guān)，在很多地方室溫的設(shè)置在晚上或者周末是不一樣的，一般來(lái)講，1℃的變化導(dǎo)致保留時(shí)間的漂移大約在1%到2%。

5、反相色譜鍵合相發(fā)生了“相塌陷”。由于流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例太少，高鍵合覆蓋率、“完全封端”的C18沒(méi)有很好的被流動(dòng)相浸潤(rùn)，這會(huì)使得流動(dòng)相和固定相沒(méi)有很好的接觸，造成鍵合相卷曲，固定相之間相互吸附，從而導(dǎo)致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少，使得保留時(shí)間逐漸變短。這時(shí)候立即用一定量的有機(jī)溶劑（建議40%乙腈水）沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復(fù)，這種現(xiàn)象在短鏈烷烴結(jié)合，未封尾的反相鍵合相上則很少發(fā)生或者是不發(fā)生。

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